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    • TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒
    產(chǎn)品名稱(chēng):

    TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒

    產(chǎn)品品牌: 價(jià)格:
    廠(chǎng)商性質(zhì): 生產(chǎn)廠(chǎng)家 產(chǎn)品時(shí)間: 2024-04-16
    TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒
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    Ex/Em (nm)556/579MWN/ACAS #N/ASolventN/AStorageF/D/LCategoryCell Analysis
    Cell Cytotoxicity

    產(chǎn)品概述

    貨號T2190規格50T
    供貨周期現貨主要用途Printer Friendly Version
    應用領(lǐng)域醫療衛生,化工,生物產(chǎn)業(yè),石油

    TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒

    細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端,從而可進(jìn)行凋亡細胞的檢測,這類(lèi)方法稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂,因而沒(méi)有3'-OH形成,很少能夠被染色。由此,TUNEL成為了檢測DNA段化(細胞凋亡)的常用方法。(以下是TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光))
    二、TUNEL實(shí)驗中關(guān)鍵步驟
    1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先 60ºC 20 min,再用使用二甲苯兩次 5-10 min;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,這些以便后面的結合反應充分、均勻;
    2.把握好細胞通透的時(shí)間。一般根據切片的厚薄,選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間,常用 10-30 min,幾 μm 切片用短時(shí)間;幾十 μm 切片用長(cháng)時(shí)間,通過(guò)摸索達到既不脫片,有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內。
    3.適當延長(cháng) TUNEL 反應液的時(shí)間。一般是37ºC 1 h,你也可以根據你的凋亡損傷程度,選擇更長(cháng)的時(shí)間,可長(cháng) 2 h,但要結合你終的背景著(zhù)色。
    4.DAB 顯色條件的選擇。一般 DAB 反應10 min 左右,結合鏡下控制背景顏色,長(cháng)不超過(guò) 30 min;promega 公司提供的 DAB 液(桃紅色),不利于辨認棕褐色,我不太喜歡。
    5.PBS 的充分清洗。我個(gè)人認為,在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格,可增加次數達 5 次,因為這些清洗直接決定后切片的非特異性著(zhù)色。
    6. 此外,內源性 POD 的封閉也十分關(guān)鍵。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織,我的經(jīng)驗是適當延長(cháng)封閉時(shí)間和升高過(guò)氧化氫的濃度,可以達到很好的封閉效果,且不影響終的特異性染色。
    三、細胞通透的時(shí)間選擇
    1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜,從而使反應試劑充分進(jìn)入細胞核進(jìn)行反應,提高陽(yáng)性率。但濃度過(guò)高或孵育時(shí)間太長(cháng)容易脫片,只要不脫片,好像影響不大,其作用類(lèi)似與 TritonX100 等細胞通透劑。
    2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10 mg/ml,可用 PBS 配制,也可用蛋白酶K緩沖液(100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA);然后分裝成小份,用完一支再用下一支,-20ºC保存 1 個(gè)月應該沒(méi)問(wèn)題的(重復拿的那支),而一直冷凍的少可以用半年以上。
    3. 蛋白酶K反應時(shí)間一般為10-30 min,具體時(shí)間長(cháng)短與切片厚薄有關(guān),4 μm左右的片子可以用 10 min,但30 μm左右的可用30 min,終通過(guò)摸索時(shí)間。過(guò)長(cháng)易脫片、過(guò)短起不到通透效果。
    關(guān)鍵試劑操作條件
    DAB 顯色反應大約需要10 min,要控制好反應時(shí)間,勿使背景顏色過(guò)深。具體的可能還是得根據切片組織來(lái)源和切片厚度、試劑盒種類(lèi)不同來(lái)摸索一下。
    蛋白酶K工作液處理時(shí)間、溫度須在范圍內摸索,溫度過(guò)高,時(shí)間過(guò)長(cháng),易破壞核酸結構,出現假陽(yáng)性。
    DNase 1 一般室溫,10 min 即可。
    四、如何減弱非特異性染色
    若是肝臟或腎臟,因富含內源性過(guò)氧化物酶,需要增加過(guò)氧化氫濃度和延長(cháng)孵育時(shí)間。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時(shí)間、PBS 充分清洗,注意鏡下把握好著(zhù)色。
    Tips
    1.濕盒用帶蓋方盤(pán),里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片,使用時(shí)稍加水即可。
    2.英文說(shuō)明書(shū)中對組織細胞通透這一步中,加了“對難處理的組織的處理”,意思是用常規方法處理(如蛋白酶 K)后,應該陽(yáng)性而做不出陽(yáng)性時(shí),可用微波修復。
    3.復染的目的是為了襯托組織形態(tài)結構,以利于結果分析,石蠟切片常用蘇木素,核染成蘭色,冷凍切片常用甲基綠,核染成綠色。
    4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制,現在有賣(mài)的,自己加蒸餾水稀釋后即可用,很方便,也不貴。
    5.蛋白酶 K 消化蛋白后,需要用封閉液。

    參考文獻:
    《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影響因子:3.062 PMID:30076744
    《Crizotinib induces apoptosis of lung cancer cells through JAK-STAT pathway》 作者:Hongmin Lu Shibo Wu Huafei Chen Ying Huang Guoqin Qiu g Liu Yong Li 期刊:Oncology Letters 影響因子:1.871 PMID:30333870
    《Knockdown of TLR4 attenuates high glucose-induced podocyte injury via the NALP3/ASC/Caspase-1 signaling pathway》 作者:Yang Liu,Zhonggao Xu,Fuzhe Ma,Ye Jia,Guannan Wang 期刊:Biomedicine & Pharmacotherapy 影響因子:3.743 PMID:30257355


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    TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒

     

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